Kauf / Beschaffung eines Mikroskops "LSM 980 FCS 34ch-spectral with Airyscan.2"

Die Fluoreszenzmikroskopie ist aufgrund ihrer potenziell hohen Spezifität und Empfindlichkeit eine der wichtigsten Methoden auf dem Gebiet der modernen biomedizinischen Forschung. Moderne Färbemethoden ermöglichen die spezifische Markierung einer Vielzahl von Molekülen mit verschiedenen Farbstoffen in ein und derselben Probe. Diese Informationen können genutzt werden, um wertvolle Rückschlüsse auf die Lokalisierung, Interaktion und Migration von Molekülen in biologischen Proben zu ziehen. Dazu müssen verschiedene Moleküle in der Probe nachweisbar sein und der Nachweis muss in einem räumlich klar definierten Volumen möglich sein, ohne dass Signale aus darüber oder darunter liegenden Ebenen stören. Letzteres ermöglichen so genannte konfokale Laser-Scanning-Mikroskope, bei denen das Emissionslicht selektiv aus der Fokusebene (mit Hilfe einer optischen Lochblende) detektiert wird. Dank dieser Fähigkeit sind konfokale Mikroskope wahrscheinlich die am weitesten verbreiteten Mikroskope im Bereich der biomedizinischen Forschung, die auch bildgebende Einzelmolekülverfahren wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ermöglichen. Die "klassischen" konfokalen Mikroskope leiden jedoch unter verschiedenen Einschränkungen: Zum einen führt die punktuelle Abtastung der konfokalen Aufnahme zu eher langsamen Bildgebungsraten, zum anderen ist die Anzahl der parallel verwendbaren Fluorophore begrenzt, ebenso wie die erreichbare räumliche Auflösung. Die räumliche Auflösung wird durch die Physik der Lichtbeugung eingeschränkt. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene so genannte Superresolution-Techniken entwickelt, um diese Beschränkung zu überwinden. Die verschiedenen Lösungen unterscheiden sich in der erreichbaren räumlichen Auflösung, aber auch in der zeitlichen Auflösung, der Größe des Abbildungsfeldes und der Lichtmenge, mit der die Probe belichtet werden muss. Experimente mit lebenden Proben erfordern schonende Beleuchtungsbedingungen und häufig eine hohe zeitliche Auflösung, was die Auswahl an Mikroskopietechniken einschränkt. Für die geplanten Experimente sollte das Mikroskop eine Bildgebungsmethode mit hoher räumlicher Auflösung (zur Auflösung molekularer Komplexe wie z. B. Membranporen) bei minimalem Photo-Bleaching (um die Phototoxizität gering zu halten) und schnellen Aufnahmegeschwindigkeiten für FRAP-, FLIP- und FCS-Studien bieten. Darüber hinaus erfordern viele geplante Experimente eine hohe zeitliche Auflösung, um dynamische Veränderungen zellulärer Eigenschaften wie das Membranpotenzial und die Makromolekülanordnung sichtbar zu machen, ohne das Sichtfeld drastisch zu verkleinern oder die Signalqualität zu verlieren, indem die Geschwindigkeit des Punktscanners des konfokalen Mikroskops auf sehr hohe Geschwindigkeiten erhöht wird. Diese Anforderungen werden durch das Konzept der "Image-Scanning-Mikroskopie" erfüllt, bei dem der klassische Punktdetektor eines konfokalen Mikroskops durch ein Detektorarray ähnlich einer Kamera ersetzt wird. Dies ermöglicht eine bessere Auflösung sowie eine höhere Effizienz der Signaldetektion durch einen Rechenschritt, der als "Pixel-Neuzuordnung" bekannt ist. Das Vorhandensein eines solchen Detektors kann auch dazu genutzt werden, die zeitliche Auflösung zu erhöhen. Zu diesem Zweck muss die Beleuchtung von einem einzelnen Punkt auf eine kurze Linie ausgedehnt werden, die den Bereich mehrerer "Pixelreihen" abdeckt, die gleichzeitig abgebildet werden können, was zu höheren Bildraten führt (dies wird manchmal als "Multiplexing" bezeichnet). Die gleichzeitige Markierung von Proben mit mehreren Farbstoffen wird häufig durch die Breite der Emissionsspektren erschwert, die sich überschneiden und zu einer Vermischung der Signale in verschiedenen Detektionskanälen führen können. Dieses Problem kann durch ein Verfahren namens "spektral aufgelöste Detektion" gelöst werden, bei dem das Mikroskop die detektierten Photonen nach einem bekannten Referenzspektrum sortieren und dadurch verschiedene Farbkanäle innerhalb eines aufgenommenen Bildes trennen kann ("spektrale Entmischung"). Dazu muss das Mikroskop zu einer spektral aufgelösten Detektion fähig sein, bei der die Anzahl der Detektionskanäle gleich oder größer ist als die Anzahl der Markierungen, und eine hohe Detektionseffizienz aufweisen (QE > 40 % für grünes Licht). Dies ist wichtig, da das erfasste Signal in mehrere Detektionskanäle aufgeteilt wird, was zu einem geringen Signal in jedem einzelnen Kanal führt.

Das Zeiss LSM 980 Airyscan2 ist das einzige konfokale Mikroskop, das alle oben genannten Anforderungen erfüllt.