Fluoreszenzmikroskop

Für die geplanten Einzelmolekülmessungen zur Aufklärung diffiziler Konformationsdynamiken von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) in lebenden Zellen ist eine gleichmäßige, artefaktfreie Ausleuchtung des Bildfeldes essenziell, da diese die Grundlage für die zuverlässige Detektion einzelner, mit nur einem Fluorophor markierter, Rezeptoren bildet. Die Erfassung der schnellen Konformationsdynamiken einzelner Rezeptormoleküle erfordert zudem eine hohe zeitliche Auflösung mit einer Bildrate von mindestens 30 ms pro Bild. Im Rahmen der Evaluierung hochauflösender TIRF-Mikroskopsysteme, die diesen anspruchsvollen Anforderungen gerecht werden, konnten wir lediglich zwei kommerzielle Angebote ausfindig machen, die im Folgenden verglichen werden: - Visitron Systems GmbH (Angebot Q-254-2Du-05/25): VS Orbital 110 IsoTIRF, basierend auf dem Zeiss AxioObserver, ausgestattet mit einer Hamamatsu ORCA-Quest 2 Kamera und der VisiView Software. - Evident Europe GmbH (Angebot Q-132202): IXplore TIRF - SAFe M90, mit Hamamatsu ORCA-Fusion BT Kamera und cellSens Software. Beide Systeme bieten modernste Technologie für TIRF-Mikroskopie, unterscheiden sich jedoch in mehreren entscheidenden Punkten, die für unsere geplanten Einzelmolekülexperimente von zentraler Bedeutung sind. Das VS Orbital 110 IsoTIRF überzeugt im direkten Vergleich deutlich. Es bietet ein großes, ebenmäßig ausgeleuchtetes Sichtfeld von ca. 350 µm Durchmesser (mit einem 63x Standardobjektiv) bei einer minimalen Inhomogenität von nur 5 % am Rand. Die innovative 2D galvo-gesteuerte Laser-Ringausleuchtung in Kombination mit der Visitron Homogenizer-Technologie gewährleistet eine artefaktfreie Darstellung ohne Interferenzen oder Schattenbildung - ein entscheidender Vorteil für die hochpräzise Analyse dynamischer Konformationsänderungen von Rezeptoren. Im Gegensatz dazu bietet das ASTER Ausleuchtungssystem (IXplore TIRF - SAFe M90) zwar ebenfalls eine gleichmäßige Ausleuchtung (250 × 250 µm bei 60x Objektiv), jedoch ist die Bildrate bei diesem Setup stark abhängig von der Größe des Bildfeldes. Um eine für Einzelrezeptor-Dynamiken notwendige Bildrate von 30 ms zu erreichen, muss das Sichtfeld auf lediglich 20 × 20 µm reduziert werden, was mit einem erheblichen Informationsverlust einhergeht. Das Visitron-System ermöglicht hingegen hohe Bildraten bei gleichzeitig großem Sichtfeld - ein Alleinstellungsmerkmal unter den kommerziell erhältlichen TIRF-Mikroskopen. Auch bei der Steuerung von Anregungswellenlängen bietet das Visitron-System klare Vorteile: Die ViRTEx-210 VS Realtime Experiment Control erlaubt einen TTL-basierten Wechsel der Wellenlängen in unter 2 ms. Dies ist insbesondere bei Mehrfarbenaufnahmen oder bei dynamischen Experimenten mit alternierender Anregungswellenlänge entscheidend. Das Evident-System hingegen benötigt 100 ms für den Wellenlängenwechsel, was für unsere geplanten Anwendungen deutlich zu langsam ist. Darüber hinaus überzeugt das Visitron-Angebot durch eine deutlich leistungsstärkere Kamera: Die integrierte Hamamatsu ORCA-Quest 2 bietet eine außergewöhnlich hohe Quanteneffizienz von 85 %, eine sehr niedrige Rauschleistung von 0,27 Elektronen (rms - Ultra Quiet Scan) sowie eine hohe räumliche (4,6 µm Pixeldurchmesser) und zeitliche (125 fps Vollbild- Fast Scan) Auflösung. Diese Kombination ermöglicht eine präzise Bildgebung selbst bei sehr schwacher Emission und erfüllt die hohen Anforderungen unserer Einzelmolekülmessungen optimal wie wir bereits in Praxistests verifizieren konnten. Im Vergleich dazu ist die im Evident-Angebot enthaltene Hamamatsu ORCA-Fusion BT der ORCA-Quest 2 in allen relevanten Parametern unterlegen: mit größerem Pixeldurchmesser (6,5 µm), niedrigerer zeitlicher Auflösung (89 fps Vollbild- Fast Scan) und einer höheren Rauschleistung (0,7 Elektronen (rms- Ultra Quiet Scan) )ist sie für unsere Anforderungen ungeeignet. Ein Austausch der Kamera ist nicht möglich, da die ORCA-Quest 2 nicht mit der Software dieses Systems kompatibel ist. Kein anderer Anbieter auf der Welt erreicht die spezifischen technischen Voraussetzungen, die zwingend erforderlich sind, um unsere wissenschaftlichen Fragestellungen zu beantworten. Aus diesem Grund wird der Fa. Visitron Systems GmbH der Zuschlag erteilt.