Beschaffung eines Hydra Bio CX Small Dual Beam Mikroskop der Firma Thermo Fischer Scientific

Am Max-Planck-Institut für Biochemie (MPIB) ist eine Forschungsgruppe für KryoEM Technologie eingerichtet. Die Gruppe widmet sich unter der Leitung von Prof. Dr. Jürgen Plitzko der Entwicklung und Anwendung innovativer Werkzeuge und Technologien in der Kryo-Elektronenmikroskopie (cryoEM) und insbesondere der Kryo-Elektronentomographie (cryoET). Prof. Plitzko stellt den Beschaffungsbedarf und dessen Gründe wie folgt vor (Auszug): Zu Forschungszwecken möchte die Forschungsgruppe ein hochauflösendes Rasterelektronenmikroskop (FE-REM bzw. FE-SEM: Field-Emission-Scanning Electron Microscope) mit einem hochmodernen fokussierten induktiv gekoppelten Plasma-Ionenstrahl beschaffen. Das Mikroskop soll sowohl für die kryogene Probenpräparation als auch die Bildgebung, insbesondere die Kryo-Volumen-EM-Bildgebung, verwendet werden. Kryogene Proben ('Frozen-hydrated') sind vitrifizierte Proben, die sowohl mittels Schockgefrieren bei atmosphärischem Druck ('Plunge-freezing') als auch unter Hochdruck ('High-pressure freezing; HPF'), bei ca. 2000 bar, hergestellt werden. Die Proben sollen mit einem Plasma-Ionenstrahl (Focused-Ion-Beam, FIB) präpariert werden. Dieser Plasma-Ionen-Strahl dient der gezielten Entfernung von Material (Ablation). Der fokussierte induktiv gekoppelte Plasma-Ionenstrahl soll eine ortsspezifische großvolumige Materialentfernung und präzises Top-Down- und Querschnittfräsen ermöglichen. Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von Plasmaquellen sind die höheren Strahlströme. Dies ermöglicht die Ablation von großen, unter hohem Druck gefrorenen Gewebeproben mit bis zu einer Größenordnung höheren Ablations-Raten im Vergleich zu herkömmlichen Flüssigmetall-Ionen-quellen, die häufig mit Gallium-Ionen betrieben werden.

Kryo-FIB/SEMs (Focused-Ion-Beam Scanning Electron Microscope) werden in der Regel für die Präparation von TEM-Lamellen verwendet. Diese Lamellen, die 100-200 Nanometer dick sind und lateral mehrere zehn Mikrometer messen, sind die Grundvoraussetzung für hochauflösende Strukturuntersuchungen für die Kryo-Elektronentomographie aus biologischem Material.

Der Materialverlust ist ein großes Problem und die Bearbeitungszeiten für die Erzeugung von Lamellen aus großen Proben erstrecken sich mit den derzeit in der Forschungsgruppe vorhandenen Geräten über mehrere Tage. Mit herkömmlichem Gallium-betriebenen FIBs ist dieses Problem noch vergrößert, da es sowohl in den gegebenen Abtragungsraten als auch in den verwendeten Strahlströmen limitiert ist. Proben bis maximal 40 Mikrometer Dicke können zwar bearbeitet werden, jedoch ist der Zeitaufwand dazu enorm.

Schwerere Plasma-Ionen wie Xenon, die auch bei hohen Strahlströmen eine vorteilhafte lineare Beziehung aufrechterhalten, verkürzen die Zeit für die Lamellenerzeugung. Dies steht im deutlichen Gegensatz zu Gallium (Flüssigmetall-Ionen). Damit ist die Präparation von Proben die dicker sind als 40 Mikrometer mit einem Plasma FIB möglich. Dies bedeutet, dass auch Proben bis zu einer Dicke von 300 Mikrometern mit dem Plasma FIB zugänglich gemacht werden. Daher soll das Mikroskop mit Xenon-Ionen betrieben werden können.

Das Mikroskop soll neben Xenon über drei weitere Arten von Plasma-Ionen verfügen, die unabhängig voneinander verwendet werden können. Konkret: Sauerstoff, Argon- und Stickstoff-Ionen. Das ermöglicht die Verfolgung von so genannten Multi-Ionen Präparationsansätzen, d.h. ein Basisfräsen mit Xenon, ein Fein-Fräsen mit Argon oder Sauerstoff, um mögliche Strahlenschäden durch den Fräsvorgang zu minimieren. Ansätze, die bereits in den Materialwissenshaften verwendet werden, jedoch noch nicht bei kryogenen Temperaturen. Dies soll nun erforscht werden. Inwieweit Stickstoff (N) Vorteile bei kryogenen Proben bietet, ist zurzeit noch wenig erforscht.

Die Volumenbildgebung wird in der Regel mit Argon-Ionen durchgeführt, die zwar kleiner als Gallium-Ionen sind, aber höhere Ströme als Gallium-Ionen ermöglichen und auch weniger "Vorhang"-Artefakte ('Curtaining') beim Fräsen verursachen. Das gleiche gilt für Sauerstoff (O), welches ebenfalls Vorteile, wie geringere Aufladungen beim Fräsen als auch beim Volume-Imaging aufweist.

Da große Mengen an Gewebeproben entnommen werden, ist es außerdem unerlässlich, in diesen riesigen 'Landschaften', respektive Volumina navigieren zu können, bestimmte Regionen darin anzuvisieren und so den Gesamtkontext beizubehalten. Daher ist die Fähigkeit zur multimodalen Bildgebung mit Fluoreszenz-Licht-Mikroskopie bzw. mit dem Rasterelektronen-Mikroskop (REM, VolumeEM) zwingend erforderlich, um ein Navigieren zu ermöglichen und auch die verschiedenen Längenskalen zu überbrücken.

Das Gerät muss sowohl das "On-the-Grid"-Lamellenfräsen als auch die Präparation von Lift-Out-Lamellen unterstützen. Dazu bedarf es eines Mikromanipulators, der die Präparation von Lift-Out-Lamellen bei kryogenen Temperaturen unterstützt. Hiermit soll das Serial-Lift-Out-Verfahren weiterentwickelt werden, welches als eine bahnbrechende Methode für den Zugang zu Gewebe und mehrzelligen Organismen auf molekularer Ebene angesehen werden kann und einen Forschungsschwerpunkt der Forschungsgruppe von Prof. Plitzko bildet.

Die Forschung hat zum Ziel, das Serial-Lift-Out Verfahren vollständig zu automatisieren und so die Anwendung von den Fähigkeiten des Benutzers zu entkoppeln und den Prozess zu beschleunigen. Zu diesem Zweck muss die Software des Gerätes über eine Scripting-Option für die von der Forschungsgruppe selbst entwickelte Software SerialFIB verfügen.

Zudem muss das Gerät über Kryo-Schleusen und Halter verfügen, die mit der bestehenden Instrumentation der Mandantin kompatibel sind.