Laser-Mikrodissektion-System

Das Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften - ISAS - e.V. beabsichtigt die Beschaffung eines Laser Mikrodissektions Systems "Leica LMD7", welches zur Optimierung von MS-basierten Messtrategien für LMD-isolierte Gewebeproben benötigt wird, zur Isolation von Zellarealen aus Nieren- und Herzgewebe, zur Kontrolle von MALDI MSI Analysen sowie zur simultanen Isolation von einzelnen Neutrophilen Granulozyten, B-Zellen aus Weichgeweben (z.B. Herz, Darm, Gehirn) und Makrophagen und Blutgefäßen aus Knochen und Herzgewebe. Im Vordergrund der Beschaffung steht aufgrund der o.g. Verwendungszwecke die hohe Leistungsfähigkeit des Systems bezüglich seiner Präzision und einer hoch-Durchsatz Anwendung (automati-sierte Isolation einzelner Zellen) sowie die hohe Anwendungsbreite des Systems (Isolationen aus verschiedenen Gewebetypen und Zellkulturansätzen) insbesondere im Kontext von Fluoreszenz-markierten Proben. Einer der technischen Schwerpunkte des Leibniz-Instituts für Analytische Wissenschaften - ISAS - e.V. liegt auf der Entwicklung und Anwendung fluoreszenzmikroskopischer Verfahren. Während Fluoreszenzmikroskopische Verfahren die simultane Lokalisation multipler Zelltypen in Geweben und insbesondere die multiple Analyse intrazellulärer Strukturen ermöglichen, ist dies mit klassischer Durchlichtmikroskopie nur schwer möglich. Folglich werden am ISAS Gewebeproben und Zellkulturansätze nahezu ausschließlich unter Anwendung von Fluoreszenzbasierten Färbestrategien analysiert. Dementsprechend ist zusätzlich zum klassischen Durchlichtmodus das live-Schneiden von Gewebestrukturen und einzelnen Zellen im Fluoreszenzmodus eine essenzielle Geräteanforderung, um eine präzise Isolation der Zielstrukturen gewährleisten zu können. Insbesondere aus der Anforderung der Analyse von Einzelzellen und intrazellulären Strukturen ergibt sich die Notwendigkeit, von möglichst hochauflösenden Laser Mikrodissektions-Trocken-Objektiven (bis zu 150x) für die möglichst präzise Isolation einzelner Zellen dieser Zielstrukturen, eine Pulsenergie von mindestens 100µJ und einer Pulswiederholrate von mindestens 20-5000Hz zur Zeitersparnis und Probenschonung bei der Dissektion. Zudem muss eine hohe Probenschonung durch einen motorisierten Beleuchtungs-Manager im Durchlicht- und Fluoreszenzmodus und durch Steuerung der Fluoreszenz-Intensitäten gewährleistet sein, um lichtinduzierte Bleichungseffekte (Photobleaching) zu vermeiden. Diese zerstören Fluoreszenzsignale und machen somit eine präzise Lokalisation und Isolation fluoreszent markierter Zielzellen oder Zielstrukturen unmöglich. Weiterhin muss für die Untersuchungen eine möglichst hohe Präzision des Lasermoduls für exakte Schnittführung, individuelle Anpassung der Schnittgeschwindigkeit an die Probenanforderungen (z.B. Größe und Dicke der Probe) und eine hohe Präzision des Scanning-Tisches für genaue Proben-Repositionierungen bei hoch-Durchsatz Isolationen sichergestellt sein. Eine effiziente Strukturlokalisation bei hoch-Durchsatz Isolationen setzt einen Übersichtsmodus mit Zoom-Funktion voraus, ebenso wie eine automatisierte Zellerkennung (AVC). Da im Anschluss an die Laser Mikrodissektion hochpräzise Analysemethoden wie die Massenspektrometrie erfolgen sollen - ein weiterer technischer Schwerpunkt des ISAS - müssen die hohen Anforderungen an die Probenqualität durch eine möglichst schonende und Kontaminationsfreie Sammlung der isolierten Strukturen (über Schwerkraft) gewährleistet werden. Die Massenspektrometrischen Analysen unvoreingenommener (unfixierter) Gewebeproben erfordern einen unmittelbaren Transfer in Protease-Inhibitoren (PI)-haltige Lysepuffer, der die Proteine vor Proteolyse schützt. Würde das Dissektat NICHT in PI-haltigen Lysepuffer unmittelbar aufgenommen werden, könnten die im Gewebe präsenten Proteasen das Proteom verändern und die Charakterisierung des Proteoms wäre nicht mehr repräsentativ. Diese Strategie zur Probenaufbereitung ist am ISAS langjährig etabliert und essenziell, um die Probenidentität sowie die Reproduzierbarkeit der bisher erzielten Forschungsergebnisse zu gewährleisten. Dementsprechend ist ein aufrechter Mikroskopaufbau mit aufrechter Probenhalterung, die das Vorlegen des Lysepuffers in den Auffangbehältern ermöglicht, essenziell. Neben Gewebeschnitten erfolgen am ISAS auch Analysen von Zellkultur-Ansätzen. Dementsprechend ist die Kompatibilität des Laser Mikrodissektion Systems mit Probenhaltern und Probengefä-ßen (z.B. Petrischalen und Lochboden-Membran-Objektträgern) zur Selektion von kultiviert adhärenten Zellen essenziell. Am ISAS werden primär Hochdurchsatzanalysen sowie Vergleiche verschiedener Zellen oder Gewebeareale aus derselben Probe durchgeführt. Zur Gewährleistung eines zeitsparenden, effizienten Arbeitsprozesses sind multiple Auffangbehälter wie beispielsweise Reaktionsgefäß-Streifen (tube strips) oder Lochbodenplatten essenziell. Insbesondere der Einsatz von 384-Loch-Mikrotiterplatten sind für die Arbeitsprozesse am ISAS relevant. Folglich stellt die Kompatibilität des Systems mit 384-Loch-Mikrotiterplatten ein zentrale Geräteanforderung dar. Da im Kontext der geplanten Hochdurchsatz-Isolationen ein großer Verbrauch an Reaktionsgefäßen zu erwarten ist, sollen diese Folgekosten durch eine kosteneffiziente Probengenerierung basierend auf der Gerätekompatibilität mit Standard-Reaktionsgefäßen (z.B. PCR-Tubes, 96- oder 384- Loch-Mikrotiterplatten) möglichst reduziert werden. Darüber hinaus ist eine Kompatibilität mit in-Haus Geräten hinsichtlich der Nachnutzung bestehen-der Systeme und Erweiterung der jeweiligen Gerätespezifikationen wünschenswert (z.B. Objektive und Fluoreszenzfilter, die zwischen den Geräten getauscht werden können).